La película ganadora de la Palma de Oro está basada en hechos reales. Ambientada en la década de 1750, la película está narrada por el cardenal Altamirano (Ray McAnally) . Describe que la orden de los jesuitas de la Iglesia ha estado trabajando estrechamente con los pueblos nativos guaraníes en América Latina dentro del territorio controlado por España. En el territorio español, las misiones de la Iglesia están protegidas, los nativos pueden controlar su propia propiedad dentro de las misiones y la esclavitud está prohibida. El jesuita Padre Gabriel (Jeremy Irons) ha abierto la comunicación con un territorio antes hostil de los guaraníes que viven encima de una enorme cascada. El padre Gabriel utiliza la música como medio para superar la barrera del idioma.

Mientras vive en la Misión, el padre Gabriel conoce a un español mercenario llamado Rodrigo Mendoza (Robert DeNiro). Mendoza captura a los guaraníes que viajan fuera de las fronteras de la Misión y los vende como esclavos en el territorio latinoamericano controlado por Portugal, donde la esclavitud es legal. Cuando Mendoza regresa de un viaje a las montañas, se entera de que su prometida se ha enamorado de su hermano. En un ataque de celos, ataca y asesina a su hermano. Aunque Mendoza queda impune por sus actos, cae en una profunda depresión y se refugia en la Iglesia local.

Mientras está de permiso en su misión, el padre Gabriel aconseja a Mendoza y lo convence de que se arrepienta y vuelva con él a la misión. Mendoza, junto con tres de los compañeros sacerdotes de Gabriel, incluido el padre Fielding (Liam Neeson), emprende el largo camino hacia la Misión. Como penitencia, Mendoza se ve obligado a arrastrar su armadura y sus armas montaña arriba. Cuando llegan a los guaraníes, un joven guerrero apunta con un cuchillo a Mendoza, reconociéndolo como el esclavista que había capturado y vendido a muchos de sus compañeros nativos. En lugar de matar a Mendoza, el nativo muestra piedad y lo libera de su armadura. Mendoza encuentra la redención y la paz entre los nativos. Con el tiempo, el padre Gabriel permite que Mendoza se convierta en sacerdote de su orden.

Pronto surgen problemas en la Misión. Los españoles se han dado cuenta de que las misiones guaraníes han generado mucha riqueza. Hacen un trato para vender las propiedades que contienen las misiones a los portugueses, que así pueden esclavizar a los nativos y tomar el mando de las ahora rentables misiones (y repartir los beneficios posteriores con los españoles). Gabriel socava el trato argumentando que las Misiones permanecerían bajo el control y la protección soberana de la Iglesia. En consecuencia, el Vaticano envía al cardenal Altamirano para que juzgue si las Misiones seguirán bajo el control de la Iglesia o perderán dicha protección tras la venta a los portugueses.

Los diplomáticos portugueses y españoles argumentan que los guaraníes son como bestias salvajes y no tienen derechos. Gabriel refuta esa teoría y Altamirano (él mismo un antiguo jesuita) parece asombrado por las granjas construidas por los nativos, así como por la pureza de su fe en Jesús. Los jesuitas también destacan las atrocidades cometidas por las potencias europeas, y Gabriel señala que los guaraníes sólo matan a sus terceros hijos porque no pueden huir de los esclavistas llevando más de un hijo a la vez. Mendoza proclama públicamente que los españoles se dedican a la trata de esclavos violando sus propias leyes. Pronto, las potencias europeas intentan sobornar a Altamirano. Aunque acepta el dinero, dice que se dejará dictar por su conciencia.

Gabriel lleva a Altamirano a su Misión, que Altamirano compara con el Jardín del Edén. Sin embargo, Altamirano finalmente emite su juicio de que las Misiones perderán su protección eclesiástica cuando las tierras sean vendidas a los portugueses. Dice que los guaraníes pueden volver pacíficamente a la selva (y al hacerlo, pueden volver a la "seguridad" del territorio español, pero deben abandonar sus Misiones, económicamente deseables, a los portugueses). El rey de los guaraníes rechaza esta oferta y dice que luchará por su tierra. Altamirano también se lleva a Gabriel aparte y le dice que si los jesuitas apoyan a los guaraníes, será excomulgado y la propia orden de los jesuitas puede ser disuelta. Gabriel dice que no luchará, pero que se quedará en la Misión entre su gente. Todos los demás sacerdotes, incluidos Mendoza y Fielding, declaran su intención de ayudar a los guaraníes a luchar. Gabriel se niega a ayudarlos o a bendecir su esfuerzo, diciendo que sólo a través del amor pueden ganar (y que no quiere vivir en un mundo donde la guerra es la única respuesta). Sin embargo, le entrega a Mendoza su cruz y le dice que, si Dios lo aprueba, Mendoza saldrá victorioso.

Los imperios portugués y español envían una fuerza de coalición para asaltar la Misión (después de esclavizar por la fuerza a todos los demás nativos en otras Misiones). Mientras tanto, Fielding y Mendoza roban algunas de las municiones y armas de los militares europeos y entrenan a los guaraníes en la guerra. Cuando llegan los europeos, al principio se ven superados por las fuerzas guaraníes. Sin embargo, pronto la superioridad numérica y de fuego de los europeos empieza a abrumar a los nativos y éstos masacran a todos los guerreros y al padre Fielding. Cuando llegan a la Misión (a la que sólo se puede acceder por un puente), encuentran al padre Gabriel dirigiendo a las mujeres y los niños en la oración y el canto. Aunque varios soldados se oponen, el asalto continúa.

Mendoza ha colocado explosivos en el puente de acceso a la Misión y está al acecho para hacerlo estallar cuando las fuerzas armadas comiencen a cruzar. Mientras espera, ve a un niño nativo herido y sale corriendo para ayudarle a huir hacia el bosque. Mientras Mendoza está fuera, las fuerzas armadas descubren y desactivan las bombas bajo el puente. Mendoza regresa al puente y es abatido tras intentar, sin éxito, hacer estallar la bomba. Yace desangrándose mientras las fuerzas armadas cruzan hacia la Misión. Mendoza se aferra a la vida para ver cómo Gabriel y su coro avanzan pacíficamente sobre los soldados, con la esperanza de que el camino pacífico de Gabriel gane el día. En cambio, los soldados abren fuego y matan a los niños y mujeres guaraníes desarmados, así como al padre Gabriel. El propio Mendoza sucumbe entonces a sus heridas.

Al final, el cardenal Altamirano critica a los diplomáticos europeos por la matanza masiva de indígenas y jesuitas. Los diplomáticos replican que esa matanza es simplemente la forma del mundo. El cardenal Altamirano no está de acuerdo y dice que esos métodos son los que la humanidad eligió para infligir al mundo. La película pasa a una escena en la que varios niños guaraníes que escaparon de la matanza regresan a la Misión quemada y rescatan un violín antes de adentrarse en la selva por su cuenta. Después de los créditos, el cardenal Altamirano mira directamente a la cámara (es decir, al espectador) con una mirada condenatoria.

La mayor diferencia entre esta película y los hechos históricos es que, aunque los jesuitas organizaron la resistencia de los nativos, no hay constancia de que ningún jesuita tomara realmente las armas contra los europeos.